丙酮酸进入线粒体是一种主动运输方式。由专门的丙酮酸载体运输（这种载体也可以运送乳酸盐）。运输方式是协同运输中的反向运输（antiport)，与线粒体中的氢氧根离子交换。运输的动力是线粒体内膜两侧的pH差（ΔpH）。ΔpH是电子传递过程中氢离子跨膜运输形成的，消耗了细胞代谢能量，所以是主动运输。
丙酮酸是利用氢离子协同运输的，线粒体内膜的这个载体是一种特殊的顺氢离子浓度的质子泵，它把所释放的能量与ATP合成偶联起来，将氢离子、ATP、丙酮酸等送过膜去。
线粒体的外膜（outmembrane）含40%的脂类和60%的蛋白质，具有孔蛋白（porin）构成的亲水通道，允许分子量为5KD以下的分子通过，1KD以下的分子可自由通过。丙酮酸的相对分子质量只有90D，能够自由通过线粒体外膜。
协同运输（cotransport）是一类靠间接提供能量完成的主动运输方式。物质跨膜运动所需要的能量来自膜两侧离子的电化学浓度梯度，而维持这种电化学势的是钠钾泵或质子泵。
线粒体的内膜（innermembrane）含100种以上的多肽，蛋白质和脂类的比例高于3：1。线粒体内膜通透性很低，仅允许不带电荷的小分子物质通过，大分子和离子通过内膜时需要特殊的转运系统。丙酮酸通过线粒体内膜是利用H+梯度协同运输的。