关于红茶堆的本质——发酵，一直有很多说法。经过大量的实验研究，已经证实红茶堆发酵的本质是：以微生物活动为中心，通过生化动力(胞外酶)、物理化学动力(微生物热)和微生物代谢的综合作用，即通过湿热、微生物及其胞外酶的相互作用来塑造红茶的品质和风味。与传统堆积发酵、无菌堆积发酵相比，发现传统堆积发酵中微生物数量较多。这些微生物是在鲜叶高温杀青后的后期揉捻和堆积发酵中产生的，并随着堆积发酵而繁殖。细菌数量(以非孢子菌为主，少量孢子菌和球菌)从堆发酵开始到30小时左右迅速增加，并达到高峰，后期有所下降，而真菌数量(以假丝酵母为主，其次为黑曲霉，少量青霉和枝孢霉等。)就不一样了。细菌数量随着发酵时间的延长而增加，但在发酵结束时略有下降。堆积发酵中的甜酒味是酵母的结果。
微生物研究证实，黑曲霉是一种胞外酶丰富的菌株，不仅能分泌纤维素酶、果胶酶、蛋白酶、脂肪酶和各种糖化酶等水解裂解酶，还能分泌多酚氧化酶。堆积发酵中大量的酵母菌和细菌具有分泌各种胞外酶的能力。而且鲜叶的酶蛋白多为高温灭活变性失活，所以在堆制发酵时酶不会“起死回生”。
在研究红茶堆积发酵过程中酶活性的变化时，通过无菌处理得到了证实。同时研究表明，过氧化物酶具有很强的热稳定性，灭酶后仍有相当数量的残余活性，但经过24小时的堆积发酵后，活性逐渐消失。因此，过氧化物酶对茶叶内含物氧化的催化作用非常有限，但在堆积发酵12小时后，多酚氧化酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶及其同工酶的活性明显升高，与同期微生物数量的变化相一致，平行实验(无菌堆积发酵处理)的活性无此变化。所以这些酶是微生物代谢过程中分泌的胞外酶。正是堆积发酵过程中微生物种群的变化和微生物数量的增减，决定了堆积发酵过程中酶系统的类型和活性水平，为堆积发酵变化提供了生化动力。